Análisis de proteína crítica.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 350 (2023) Citar este artículo

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En los últimos años, la aparición del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), como causa de la pandemia mundial de la enfermedad por coronavirus (COVID-19), y sus variantes, especialmente aquellas con mayor transmisibilidad y sustancial evasión inmune, han destacado la necesidad de desarrollar nuevas terapias como soluciones sostenibles distintas de la vacunación para combatir los coronavirus (CoV). Además del reconocimiento de receptores y la entrada de virus, los miembros del complejo de replicación/transcripción del SARS-CoV-2 son objetivos prometedores para diseñar antivirales. Aquí, se analizaron exhaustivamente los residuos que interactúan que median las interacciones proteína-proteína (PPI) de nsp10 con nsp16 y nsp14, y se investigaron los mapas de interacción, las energías de interacción, las redes estructurales y la dinámica de los residuos clave. Nsp10 estimula tanto la exoribonucleasa (ExoN) de nsp14 como la 2′O-metiltransferasa (2′O-MTasa) de nsp16. Nsp14 ExoN es una enzima correctora de ARN que respalda la fidelidad de la replicación. Nsp16 2′O-MTasa es responsable de completar la protección del ARN para garantizar una replicación y traducción eficientes y escapar del sistema inmunológico innato de la célula huésped. Los resultados del análisis de los IBP propusieron información crucial con implicaciones para el diseño de medicamentos antivirales para el SARS-CoV-2. Con base en las interfaces proteína-proteína compartidas previstas de las interacciones nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10, se diseñó un conjunto de inhibidores peptídicos de doble objetivo. Los péptidos diseñados se evaluaron mediante acoplamiento molecular, análisis de interacción péptido-proteína y cálculos de energía libre, y luego se optimizaron aún más mediante mutagénesis de saturación in silico. Según la conservación evolutiva prevista de los residuos objetivo que interactúan entre los CoV, los péptidos diseñados tienen el potencial de desarrollarse como inhibidores de pan-coronavirus de doble objetivo.

La nueva enfermedad del coronavirus humano 2019 (COVID-19), como resultado de la infección por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1, ha causado un gran número de muertes confirmadas en todo el mundo y una crisis económica mundial en años recientes. El SARS-CoV-2 es un betacoronavirus esférico envuelto que pertenece a la familia de virus ARN Coronaviridae2. El genoma del SARS-CoV-2 comparte una identidad de secuencia del 96,2%, 79% y 50% con el coronavirus del murciélago, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), respectivamente. La aparición del SARS-CoV-2 y luego sus variantes, en particular las variantes preocupantes (COV), junto con las emergencias anteriores del SARS-CoV en 2002-2003 con 8096 casos y 774 muertes (~ 10% de tasa de mortalidad) y MERS. -CoV en 2012, con 1728 casos confirmados y 624 muertes (~ 36% de tasa de mortalidad)3 demostró que los coronavirus (CoV) han sido durante mucho tiempo una gran amenaza para los humanos. También se debe considerar la patogenicidad de otros CoV humanos que causan el resfriado común, particularmente en bebés y niños4. La entrada acelerada del SARS-CoV-2 en la célula huésped comparable a otros CoV5, y la aparición de la variante Omicron (B.1.1.529) con mayor transmisibilidad (3,2 veces mayor que Delta) y sustancial evasión inmune6, así como su reciente En sublinajes emergentes, como BA.4 y BA.5, la eficacia de las vacunas existentes se ha visto disminuida, promoviendo así reinfecciones y evasión de vacunas7. Por lo tanto, las vacunas y terapias iniciales contra la COVID-19 no podrían ser soluciones prolongadas. Por lo tanto, además de desarrollar tecnologías de diagnóstico y vigilancia para el SARS-CoV-28,9,10, es imperativo desarrollar terapias novedosas para combatir los CoV como soluciones sostenibles.

Los marcos de lectura abiertos (ORF) 1a/b son los ORF más grandes del genoma del SARS-CoV-2. Estos ORF están ubicados en el extremo 5 'del genoma y codifican dos precursores de poliproteína replicasa muy grandes, pp1a y pp1ab, que se escinden postraduccionalmente mediante proteasas virales en 16 proteínas no estructurales (nsps) 11 (Fig. S1). Nsp12, nsp13, nsp16, nsp14, nsp10, nsp7 y nsp8 son miembros esenciales del complejo de replicación y transcripción (RTC) del SARS-CoV-2, que es responsable de la supervivencia, evolución y propagación viral. RTC promueve la replicación, transcripción, corrección y limitación del ARN mediante un ensamblaje complejo de interacciones nsp-nsp y nsp-ARN viral11,12,13,14.

Un proceso cotranscripcional conservado evolutivamente en el núcleo de todas las células eucariotas asegura la modificación del extremo 5 'de los ARNm nacientes con una tapa. La cápsula de ARNm actúa como un grupo molecular conservante contra la escisión de exonucleasa, estabiliza las moléculas de ARN, garantiza un transporte nucleocitoplasmático eficiente, una traducción vigorosa de proteínas dependiente de la cápsula y el procesamiento previo al ARNm, y también previene la distinción de ARN no propio en la respuesta inmune innata15,16. . Los virus han secuestrado la protección de los ARN para superar las respuestas del sistema inmunológico del huésped a través de diversos mecanismos. Los miembros de Coronaviridae han desarrollado su propio proceso de limitación específico17. El mecanismo de limitación del SARS-CoV-2 consta de cuatro pasos ejecutados por una serie de nsp, incluido nsp13 como ARN 5′ trifosfatasa (RTPasa), una guanililtransferasa (GTasa) desconocida, el C-terminal de nsp14 para N7-guanina-metiltransferasa. (N7-MTasa) y nsp16 y su cofactor crítico nsp10 para la actividad 2′O-metiltransferasa (2′O-MTasa)12,18,19 (Fig. 1b).

Representación esquemática del complejo de replicación y transcripción (RTC) de SAR-CoV-2 y su proceso de limitación de ARNm. (a) Los miembros principales del RTC del SARS-CoV-2 incluyen la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp; nsp12), una proteína multifuncional con actividades de helicasa y ARN 5' trifosfatasa (Hel-RTPasa; nsp13), enzimas metiltransferasa (MTasa; ​​nsp16 y el C-terminal de nsp14), exoribonucleasa (ExoN; el N-terminal de nsp14) y nsp10 como activador crítico para activar tanto nsp14 ExoN como nsp16 MTasa. (b) Los pasos del proceso de protección del ARNm del SARS-CoV-2: primero, el enlace interfosfato en el extremo 5' del ARN trifosforilado naciente (pppN) es hidrolizado por nsp13 como RTPasa, formando el extremo del transcrito difosfato 5'-ppN. En segundo lugar, el trifosfato de guanosina (GTP) se escinde en monofosfato de guanosina (GMP) mediante una guanililtransferasa (GTasa) desconocida y se transfiere al ARNm de 5'-difosfato para producir GpppN. En tercer lugar, la estructura cap-0 (7mGpppN) está formada por nsp14 N7-guanina-metiltransferasa (N7-MTasa) en presencia de S-adenosilmetionina (SAM). Por último, la estructura cap-1 es producida por el complejo nsp16-nsp10 con actividad 2′O-metiltransferasa (2′O-MTasa).

Estudiar los miembros de RTC y, en particular, las interacciones proteína-proteína (PPI) de nsps puede ser un medio productivo para diseñar inhibidores de interferencia prometedores para los CoV, especialmente después de la entrada viral en las células huésped. El papel vital de los IBP en casi todos los procesos biológicos los hace cada vez más atractivos para enfoques terapéuticos20. Recientemente, los péptidos de interferencia (IP) se han reconocido más comúnmente21, y la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA) ha aprobado algunos péptidos terapéuticos que se dirigen a los IBP22. Varios estudios han demostrado la potencia de los péptidos derivados para inhibir los IBP en los CoV23,24,25,26,27. Además, datos clínicos y enfoques computacionales han propuesto a las vacunas nsps contra el SARS-CoV-2 como péptidos inmunodominantes con capacidad de conferir inmunidad global frente a la COVID-1928.

Recientemente hemos investigado el patrón de unión proteína-proteína de la entrada del SARS-CoV-229. El objetivo general del estudio actual fue arrojar luz sobre las interacciones de nsp10, como un activador común tanto con la MTasa limitadora de nsp16 como con la ExoN de nsp14 en el RTC del SARS-CoV-2, y luego diseñar inhibidores peptídicos para atacar estos IBP críticos (Fig. .S2). Inicialmente, se investigaron los residuos críticos que interactúan involucrados en estos PPI y luego se analizaron desde las perspectivas de la descomposición de energía libre, mapas y energías de interacción, redes estructurales y dinámica molecular (Fig. S3). Estos análisis integrales brindan una imagen completa de los residuos críticos que son de suma importancia para mediar los mecanismos de limitación y corrección en el SARS-CoV-2. Estos residuos clave sirven como residuos farmacológicos, con implicaciones para el diseño de fármacos para el SARS-CoV-2. A continuación, de acuerdo con los resultados obtenidos, se diseñó un conjunto de péptidos inhibidores de doble objetivo en función de las interfaces proteína-proteína compartidas previstas de las interacciones nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10. Por lo tanto, estos péptidos abren una ruta novedosa para perturbar simultáneamente las maquinarias de corrección y limitación del ARN del SARS-CoV-2, con el potencial de inhibir el escape viral del reconocimiento inmunológico del huésped, aumentar la tasa de mutación y, en consecuencia, provocar efectos letales en el SARS-CoV-2. CoV-2. La conservación evolutiva prevista en todo el amplio espectro de CoV para los residuos objetivo que interactuaron con los péptidos diseñados indica la gran potencia de los péptidos diseñados que se desarrollarán como nuevos antivirales pan-coronavirus para posibles brotes actuales o futuros relacionados con CoV.

Se utilizó el Protein Data Bank (rcsb.org/)30 para obtener las estructuras complejas nsp16-nsp10 de SARS-CoV-2 (PDB ID 6W75)31, SARS-CoV (PDB ID 2XYQ)32, MERS-CoV (PDB ID 5YNB) y HCoV-OC43 (ID PDB 7NH7)33. La estructura del complejo SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 se modeló seleccionando el complejo SARS-CoV nsp14-nsp10 (PDB ID 5C8S)14 como plantilla utilizando SWISS-MODEL34.

Los residuos en las interfaces de los complejos proteína-proteína investigados se predijeron utilizando tres herramientas in silico, incluido PPCheck 35, el servicio PISA (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies) del Instituto Europeo de Bioinformática (http://www.ebi.ac .uk/pdbe/prot_int/pistart.html)36 e ISPRED437. A continuación, se predijeron los residuos del punto crítico utilizando KFC2 (FADE y contactos basados ​​en conocimientos)38, DrugScorePPI39 y Robetta40. Para mejorar la precisión de los resultados, se utilizó una combinación de herramientas para identificar interfaces y puntos críticos proteína-proteína. Un residuo se consideró un residuo clave (interfaz y/o punto de acceso) si estaba presente al menos en los resultados de dos de las tres herramientas. Además, para el análisis comparativo, también se predijeron la interfaz de PPI y los residuos de puntos críticos del complejo nsp16-nsp10 de SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43 basándose en el enfoque anterior. Los residuos clave fueron mapeados en las estructuras de proteínas por UCSF Chimera41. La gráfica de estructura secundaria para ambos complejos se predijo utilizando PDBsum42. A continuación, el mCSM-PPI2 realizó un escaneo computacional de alanina (CAS) de los residuos de interacción clave previstos de los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2 (http://biosig.unimelb.edu.au/mcsm_ppi2). /), y el impacto de cada mutación se evaluó prediciendo la diferencia en las afinidades de unión proteína-proteína entre el tipo salvaje y el mutante, que se define como ΔΔGAffinity (ΔΔG = ΔGMutant − ΔGwild-type)43. Además, se analizaron las interacciones entre los residuos de tipo salvaje y mutantes con la afinidad ΔΔGA más negativa y sus residuos cercanos. Luego, el servidor HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkdock)44 realizó un análisis de descomposición de energía libre por residuo mediante cálculos del área de superficie nacida generalizada de mecánica molecular (MM-GBSA) para el SARS-CoV-2 nsp16- Complejos nsp10 y nsp14-nsp10.

Las interacciones de los residuos se analizaron y mostraron en mapas 2D empleando DIMPLOT de Ligplot+45. Además, se utilizó el servidor de la Calculadora de interacciones de proteínas (PIC) (pic.mbu.iisc.ernet.in)46 para analizar diferentes tipos de interacciones. Además, se utilizó COCOMAPS (molnac.unisa.it/BioTools/cocomaps)47 para analizar las interfaces de PPI investigadas a una distancia de corte de 8 Å proporcionando mapas de distancia y contacto de propiedad. Además, COCOMAPS predijo las superficies accesibles de los complejos. Además, las energías de interacción (IE) entre residuos fueron predichas por el servidor web Amino Acid Interactions (INTAA) (bioinfo.uochb.cas.cz/INTAA/)48 con la ayuda del campo de fuerza AMBER parm99, similar al agua (OBC -II) medio ambiente y el modo de adición de hidrógeno. Los mapas de calor se generaron utilizando THE Heatmapper49. Todo el procedimiento se realizó para los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2.

El servidor de Análisis de Red de Estructuras de Proteínas (NAPS) (bioinf.iiit.ac.in/NAPS/index.php)50 se utilizó para el análisis de la red estructural de los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2. Los parámetros de centralidad del nodo, incluida la centralidad de grado (DC), la centralidad de intermediación (BC) y la centralidad de cercanía (CC) de los residuos en la red, se predijeron seleccionando el tipo de red no ponderada C-alfa con un umbral superior de 7 Å en el modo complejo proteico de NAPS.

El paquete AMBER1451 realizó simulaciones de dinámica molecular (MD) de los complejos nsp14-nsp10, nsp16-nsp10, así como de las proteínas nsp14, nsp16 y nsp10 utilizando el campo de fuerza ff14SB52. Los sistemas se solvataron mediante el modelo explícito de agua TIP3P en una caja octaédrica truncada en una capa de hidratación de 12 Å utilizando xleap. Se agregaron cinco iones cloruro para neutralizar los sistemas. Todos los enlaces covalentes de los átomos de hidrógeno se agregaron a los sistemas utilizando el algoritmo SHAKE53. Las interacciones electrostáticas se calcularon utilizando el algoritmo PME (Particle Mesh Ewald)54 con un umbral de 10 Å para las interacciones potenciales de Lennard-Jones en condiciones de contorno periódicas. El paso de minimización se realizó para eliminar contactos de alta energía utilizando 2000 pasos del descenso más pronunciado y 3000 pasos del método de gradiente conjugado, respectivamente. Luego, cada sistema se calentó completamente de 0 a 300 K durante 400 ps en un volumen constante. El equilibrio de los sistemas se llevó a cabo en condiciones de presión y temperatura constantes durante 1 ns. Después del equilibrio, las simulaciones se realizaron utilizando pmemd durante un período de 100 ns. Se utilizó el algoritmo de Langevin55 para controlar la temperatura dentro de las simulaciones. Finalmente, las trayectorias se analizaron utilizando cpptraj56. XMGRACE57 se utilizó para generar gráficos de desviación cuadrática media (RMSD) y fluctuación cuadrática media (RMSF).

En este estudio, los péptidos inhibidores se diseñaron basándose en dos metodologías. En el primer enfoque, los péptidos inhibidores se diseñaron manualmente en función de los residuos interactuantes superpuestos previstos de nsp10, que interactúan tanto con nsp16 como con nsp14 en el SARS-CoV-2. En el segundo enfoque, los IBP en las interfaces de los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2 se analizaron individualmente utilizando el servidor Peptiderive58 para diseñar inhibidores de péptidos dirigidos a nsp16/nsp14. Peptiderive separó sistemáticamente los péptidos de nsp10 con una ventana deslizante (con 5 a 15 longitudes en cada etapa de predicción) y luego evaluó las contribuciones de estos péptidos aislados a la interacción general.

En el primer paso, el acoplamiento molecular se realizó utilizando el servidor HPEPDOCK (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/)59 para el acoplamiento local de los péptidos diseñados con sus respectivos objetivos. Los residuos del sitio de unión de la diana se especificaron como referencia en función de los residuos de interacción clave predichos por la diana. Los mejores criterios de selección de modelos de los 10 principales modelos predichos para cada complejo péptido-objetivo fueron los siguientes: (i) el modelo que estaba unido a los residuos clave del objetivo con una pose similar en relación con la interacción de referencia e interactuaba con más residuos clave del objetivo; (ii) el modelo con RMSD relativamente bajo entre todos los modelos predichos, que se examinó superponiéndolo con la estructura de referencia; y (iii) el modelo con la puntuación de energía de atraque más baja. Cada modelo del complejo péptido-proteína se analizó utilizando DIMPLOT45 y UCSF Chimera41. Según los resultados de HPEPDOCK, los mejores péptidos se sometieron a análisis de acoplamiento adicionales. Luego, las estructuras 3D de los péptidos seleccionados se modelaron utilizando MODPEP (//huanglab.phys.hust.edu.cn/modpep/)60. Se eligió el mejor modelo y este paso fue seguido por el acoplamiento péptido-proteína utilizando HADDOCK 2.461. Los residuos de interacción clave previstos en los pasos anteriores se especificaron como residuos activos, que estaban directamente involucrados en la interacción péptido-proteína, y todos los residuos de la superficie circundante dentro del radio de 6,5 Å alrededor de los residuos activos se definieron como residuos pasivos. Es de destacar que el dominio ExoN de nsp14 se utilizó para el acoplamiento molecular. Aquí, se utilizaron los mismos criterios de selección del mejor modelo que en el paso anterior. La energía libre de unión (ΔG) y la constante de disociación (Kd) del mejor complejo del péptido objetivo diseñado obtenido mediante el segundo paso de acoplamiento se predijeron utilizando Prodigy (wenmr.science.uu.nl/prodigy)62. Además, se utilizaron cálculos de MM-GBSA utilizando el campo de fuerza ff02, 2000 ciclos de descenso más pronunciado y 3000 ciclos de minimizaciones de gradiente conjugado en HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkDock)44 para calcular las energías libres de unión del péptido. –complejos de proteínas y descomponerlos en contribuciones por residuo.

Se utilizó el método MM-PBSA63 para estimar la energía libre de unión (ΔGunión) de los péptidos diseñados con mejor puntuación a sus respectivos objetivos. Durante 50 ns, se realizaron simulaciones MD de los complejos péptido-proteína con mejor puntuación con AMBER1451. Luego, se tomaron 200 instantáneas de complejos péptido-proteína de la trayectoria en varios pasos de tiempo para calcular los valores promedio de ΔGbinding por mmpbsa.py64.

Los péptidos diseñados con mejor puntuación se optimizaron mediante análisis de mutagénesis de saturación in silico mutando cada residuo de los péptidos diseñados como secuencias principales de los otros 19 aminoácidos para generar una nueva biblioteca de péptidos. Luego, se predijo el cambio en la afinidad de unión del nuevo péptido-objetivo mutante en relación con el complejo péptido-objetivo principal (ΔΔGAffinity) y el impacto de cada mutación en la afinidad de unión péptido-objetivo utilizando mCSM-PPI243. Para evaluar más a fondo los péptidos diseñados, se calcularon sus propiedades generales, incluido el peso molecular, el punto isoeléctrico y la carga neta a pH 7, utilizando Pep-CaLc65. Además, pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)66 predijo las propiedades farmacocinéticas de los péptidos diseñados. La concentración inhibidora media máxima (CI50) de los péptidos diseñados fue predicha por el AVP-IC50Pred (crdd.osdd.net/servers/ic50avp/) utilizando la técnica de aprendizaje automático Random Forest (RF)67. La alergenicidad y toxicidad de los péptidos fueron predichas por AllergenFP v.1.068 y ToxinPred69, respectivamente. Los complejos proteína-péptido objetivo se simularon utilizando CABS-flex 2.0 (biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2/index)70 con parámetros predeterminados para analizar las fluctuaciones de los residuos y generar los gráficos RMSF.

Se realizaron múltiples alineamientos de secuencias de nsp10, nsp16 y nsp14 de siete CoV humanos, incluidos SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 y HCoV-229E. utilizando MultAlin71. Se utilizó ESPrip para renderizar las secuencias72. Para explorar los residuos conservados evolutivamente de las proteínas nsp10 y nsp16 en todas las estructuras informadas del complejo nsp16-nsp10, incluidos SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43, el servidor web ConSurf (consurf .tau.ac.il/)73 se empleó basándose en el método bayesiano. Además, se analizó la conservación de aminoácidos del modelo de proteína nsp14 del SARS-CoV-2.

En este estudio, primero, se predijeron los residuos clave en la interfaz de los complejos proteína-proteína que median los IBP. En la Fig. S3 se presenta una descripción del flujo de trabajo de este estudio. La interfaz proteína-proteína final prevista y los residuos del punto crítico de los complejos SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 se enumeran en la Tabla 1. Los residuos interactuantes clave predichos con cada herramienta se enumeran en las Tablas S1. Para el complejo nsp16-nsp10, se predijeron 33 residuos como residuos de la interfaz nsp16 y 26 residuos como residuos interfaciales de nsp10. V42, K43, M44, L45 e Y96 de nsp10, y I40, M41, V44, T48, V78, V84, Q87, V104 y D106 de nsp16 se predijeron como residuos de puntos críticos para el complejo nsp16-nsp10. Para el complejo nsp14-nsp10, se identificaron 106 residuos en la interfaz proteína-proteína, 45 y 61 residuos en las interfaces de nsp14 y nsp10, respectivamente. T5, E6, N10, S11, L14, S15, F16, F19, V21, N40, V42, M44, S72, R78, C79, H80, F89, K93 e Y96 se predijeron como puntos de acceso nsp10 en el complejo nsp14-nsp10. . Los residuos clave que interactúan para ambos complejos se asignaron a sus estructuras (Fig. 2a, b). Además, los gráficos de estructura secundaria para los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2 se muestran en las figuras S4 y S5, respectivamente.

Análisis de las interfaces proteína-proteína del SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 y de los residuos de puntos críticos. (a) Las interfaces y los puntos de acceso se asignaron a la estructura nsp16-nsp10 en las interfaces proteína-proteína de nsp16 (gris) y nsp10 (cian), que son de color naranja y rojo, respectivamente. (b) Las interfaces y los puntos de acceso en las interfaces proteína-proteína de nsp14 (magenta) y nsp10 (cian) están coloreados en amarillo y rojo, respectivamente. Los residuos de puntos críticos se muestran en etiquetas rojas. (c) Los residuos de la interfaz clave superpuesta (púrpura) y del punto de acceso (rojo) de nsp10 (cian), que interactuaron con las proteínas nsp16 y nsp14.

En particular, entre los residuos interactuantes clave de nsp10, se compartieron 24 residuos de interfaz y tres residuos de puntos críticos entre los dos complejos en SAR-CoV-2. Estos residuos clave de nsp10 interactuaron tanto con nsp16 (protección de 2'O-MTasa) como con nsp14 (corrección de ExoN). Los residuos de interfaz común superpuestos de nsp10 en estos dos complejos fueron T39, N40, C41, V42, K43, M44, L45, C46, ​​T47, V57, T58, P59, G69, G70, A71, S72, C77, R78, C79. H80, K93, G94, K95 e Y96. Los puntos de acceso comunes fueron V42, M44 e Y96 (Fig. 2c). Además, el análisis de los residuos interfaciales y de puntos de acceso de PPI indicó las interacciones entre los residuos en el bucle N-terminal y la hélice H1 del dominio ExoN nsp10 y nsp14. Además, para dilucidar las similitudes y diferencias en las interacciones de nsp10 con nsp16 entre CoV, también se predijeron las interfaces proteína-proteína y los puntos críticos del complejo nsp16-nsp10 en SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43 aplicando la mismo enfoque (Tabla S1). Los residuos, incluidos V42, K43, M44 y L45, fueron puntos críticos comunes de nsp10 en todos estos CoV. Las diferencias radicaron en T47, R78 e Y96 de nsp10 en el SARS-CoV; K58, H80 y F96 de nsp10 en MERS-CoV; y N40, C41, C46, ​​D47, V57, K58, S72, C77, R78, H80, L89, C90, R93, K95 y F96 de nsp10 en HCoV-OC43. V84, Q87, V104 y D106 fueron los puntos de acceso compartidos de nsp16 entre estos CoV (Figs. S6-S8).

A continuación, CAS analizó los residuos de interacción clave previstos utilizando mCSM-PPI2. En total, se analizaron 153 mutaciones para predecir el impacto de la sustitución de alanina en la afinidad de la unión proteína-proteína (Tabla S2). Como se muestra en la Fig. S9, las mutaciones, que incluyen respectivamente Y96A, L45A, V42A, M44A y G70A de nsp10; V84A, D106A, V44A, I40A y R86A de nsp16 en el complejo nsp16-nsp10; F16A, Y96A, H80A, E6A y F19A de nsp10, y F8A, P24A, F60A, Q22A y D10A de nsp14 en el complejo nsp14-nsp10; mostró la afinidad ΔΔGA más negativa, con los mayores impactos decrecientes en las afinidades de unión nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10. Estos resultados revelaron el papel fundamental de estos residuos en la mediación de los IBP. Todos estos residuos, excepto G70 de nsp10, R86 de nsp16 y P24 de nsp14, se predijeron como puntos críticos en el paso anterior. Sin embargo, mutaciones, incluidas T49A, V57A y C79A de nsp10, y T91A, G92A y S248A de nsp16 en el complejo nsp16-nsp10, P8A, S33A, V57A y C79A de nsp10, y T21A, C39A y K47A de nsp14 en el complejo nsp14-nsp10, mostró pequeños valores positivos de ΔΔGAffinity (<1,3 kcal/mol), lo que indica la menor importancia de dichos residuos para la formación de complejos. Las interacciones entre los residuos de tipo salvaje y mutantes con la afinidad ΔΔGA más negativa y sus residuos cercanos se muestran en las Figs. T10-T13. Además, los resultados del análisis de descomposición de energía libre por residuo utilizando el método MM-GBSA para los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 se muestran en la Tabla S3. Estos resultados indicaron que los residuos clave que interactúan contribuyeron significativamente a que los PPI unieran energía libre en comparación con otros residuos. Las energías libres de unión estimadas más bajas de L45, V42 y M44 de nsp10, y Q87, I40 y V104 de nsp16 en el complejo nsp16-nsp10; y F19, V21 y H80 de nsp10, y N130, H26 e I201 de nsp14 en el complejo nsp14-nsp10 indicaron sus mayores contribuciones en estos dos PPI, respectivamente. Los resultados de MM-GBSA fueron consistentes con la predicción del punto crítico y los resultados de CAS; sin embargo, el N130 de nsp14 no se predijo como un punto de acceso en el paso anterior.

Según el análisis de los mapas 2D de interacciones residuo-residuo en el complejo nsp16-nsp10 del SARS-CoV-2, las interacciones hidrofóbicas fueron las más abundantes (Fig. S14a). N40, V42, K43, M44, L45, P59, A71, K93 e Y96 de nsp10 contribuyeron a varias interacciones hidrofóbicas con los residuos de nsp16. Además, K43, L45, A71, K93, G94 e Y96 de nsp10 formaron enlaces H con los residuos de nsp16. A71 y G94 de nsp10 participaron en enlaces H con D106 de nsp16. Además, K43, L45, K93 e Y96 de nsp10 formaron enlaces H con K38, Q87, S105 y A83 de nsp16, respectivamente. El análisis de la interacción nsp16-nsp10 mediante PIC generó los mismos resultados que DIMPLOT (Tabla S4), lo que indica que las interacciones hidrofóbicas fueron predominantes. Además, el análisis PIC mostró que E66 y H80 de nsp10 formaron interacciones iónicas con K38 y D102 de nsp16, respectivamente. Además, para realizar un análisis comparativo, se generaron gráficos de mapas 2D de interacciones de residuos para el complejo nsp16-nsp10 en otros CoV (SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43), y los resultados se representan en las Figs. T15-T17.

Según los resultados de DIMPLOT para el complejo nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2 (Fig. S14b), las interacciones de los residuos fueron predominantemente hidrofóbicas en las interfaces proteína-proteína, similar a lo que se observó para el complejo nsp16-nsp10. El análisis de enlaces H reveló que K43 y L45 de nsp10 formaron enlaces H con el C39 de nsp14. Se encontraron otros enlaces de H entre T5, E6 y S15 de nsp10 y S28, T5 y F60 de nsp14, respectivamente. K93 de nsp10 contribuyó a las interacciones con D126 y T127 de nsp14 a través de dos enlaces H. Además, se formaron enlaces H entre N40, G94 e Y96 de nsp10 y H29, K47 y D41 de nsp14, respectivamente. De manera similar, los resultados de DIMPLOT y PIC estuvieron en la misma línea para el complejo nsp14-nsp10. Además, PIC predijo otros tipos diferentes de interacciones, es decir, iónicas, aromáticas-azufre, aromáticas-aromáticas y catión-pi, para el complejo nsp14-nsp10 (Tabla S4). Las diferencias en las interacciones de SARS-CoV-2 nsp10 con nsp16 y nsp14 radicaron principalmente en las interacciones de los residuos en el terminal N de nsp10 con nsp14, interacciones como enlaces H entre A1, A18, F19, V21 y D29 de nsp10 y K9, K196, I201, I201 e Y69 de nsp14, respectivamente. Además, N3 de nsp10 formó dos enlaces H con D10 de nsp14.

Los contactos intermoleculares con una distancia de corte de 8 Å se analizaron utilizando COCOMAPS para representar las regiones nsp16/nsp14 que están en contacto con la nsp10 del SARS-CoV-2. En los mapas de contactos de rango de distancia (Fig. S18a), los contactos intermoleculares de ambos complejos se colorean según la distancia creciente. Los pares de residuos de nsp10 y nsp16, incluidos Y96-A83, K43-K38, K93-S105, L45-Q87 y G94-D106, exhibieron una distancia mínima de <2,82 Å. Además, los pares de residuos que incluyen F60-S15, K9-A1 e Y69-D29 de nsp14 y nsp10 se observaron en el complejo nsp14-nsp10 con una distancia mínima de <2,64 Å. El mapa de contacto del complejo nsp14-nsp10 puede indicar el papel de los residuos que interactúan con nsp10 en la activación del ExoN de nsp14 en el N-terminal. No se observó contacto intermolecular entre nsp10 y el C-terminal de nsp14. La naturaleza fisicoquímica de las interacciones está indicada por los mapas de contacto de propiedades (Fig. S18b). Como se aclara en los mapas de propiedades, las interacciones hidrofóbicas contribuyeron más que las interacciones hidrofílicas para ambos complejos. Estos resultados coincidieron con los resultados de DIMPLOT y PIC. Además, COCOMAPS mostró que una gran área de aproximadamente 1852,3 Å2 quedó enterrada tras la formación del complejo SARS-CoV-2 nsp16-nsp10, y su gran área de interfaz era de aproximadamente 926,75 Å2. De manera similar, el área enterrada y el área de interfaz del SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 tras la formación del complejo eran grandes, midiendo 4358,47 y 2180,15 Å2, respectivamente.

A continuación, se analizaron las energías de interacción residuo-residuo (IE) de los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2 utilizando INTAA. Según los resultados, D106 de nsp10 y D125 de nsp16 mostraron los IE netos más negativos (- 190,6 y - 518,33 kJ/mol, respectivamente). Entre los residuos interactuantes clave previstos, E66, Y96 y S72 de nsp10, así como D106, D108 y S105 de nsp16 mostraron los IE netos más negativos. La Figura S19 muestra un mapa de calor para IE por pares residuo-residuo entre los residuos clave que interactúan predichos de nsp10 y nsp16. Los IE por pares más negativos con funciones estabilizadoras en los PPI incluyeron las interacciones entre K93 y D106, K93 y S105, A71 y D106, G94 y D106 de nsp10 y nsp16, respectivamente. Como se mencionó anteriormente, COCOMAPS predijo las distancias del par de residuos, incluidos K93 y S105, así como G94 y D106, entre las distancias mínimas en el paso anterior. El análisis de IE del complejo nsp14-nsp10 reveló que E6 de nsp10 y E284 de nsp14 mostraron los IE netos más negativos (- 504,75 y - 296,05 kJ/mol, respectivamente). E6, D29, K25 y D22 de nsp10 y D10, D126, E2 y F60 de nsp14 mostraron los IE netos más negativos entre los residuos de interacción clave predichos en el complejo nsp14-nsp10. Las interacciones entre D29 e Y69, S15 y F60, F19 y K200, E6 y V4 de nsp10 y nsp14, respectivamente, fueron las IE por pares más estabilizadoras (Fig. S20). Se predijo que todos estos residuos con las funciones más estabilizadoras en los IBP serían los residuos clave que interactúan en los pasos anteriores.

Se realizaron análisis de la red de contacto de proteínas (PCN) de los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 del SARS-CoV-2 para determinar la importancia topológica de cada residuo como nodo en la red proteína-proteína. Los parámetros de centralidad de nodo de los residuos, incluida la centralidad de grado (DC), la centralidad de intermediación (BC) y la centralidad de cercanía (CC) de los residuos en la red, se predijeron para ambos complejos (Tabla S5). En el complejo nsp16-nsp10, G69, G70, Y96, A71 y K95 de nsp10, y V44, A45, V84 y D106 de nsp16 mostraron las CD más altas entre los residuos clave predichos. Los resultados revelaron que G69, M44, G70, G94 y K95 de nsp10, y V44, D106, D108, T91 e I40 de nsp16 mostraron el BC más alto entre los residuos críticos de PPI. Se predijeron valores altos de CC de los residuos clave para M44, G69, V57, K43 y G94 de nsp10, y V44, D106, V84 y A107 de nsp16 (Fig. S21). El análisis de PCN de los residuos de interacción clave predichos de la interacción nsp14-nsp10 mostró que entre los residuos de interacción críticos, G70, Y96, A71, K95 y A20 de nsp10, y K9, D10, I55 y T131 de nsp14 mostraron DC altas. En particular, también se predijo que G70, A71, K95 e Y96 tendrían una CD alta en el complejo nsp16-nsp10, lo que indica que estas redes eran comunes en ambos complejos. Además, F19, S15, A20, A18 y V21 de nsp10, y G59, F60 e Y69 de nsp14 mostraron la CC más alta entre los residuos clave. Se predijeron valores altos de BC de los residuos clave para T5, A18, C79, A20 y F19 de nsp10, y G6, T25, G59, Y69 y F60 de nsp14 (Fig. S22). Las redes 3D de los complejos nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 y sus interfaces resaltadas se muestran en la Fig. S23.

Para investigar la estabilidad, las fluctuaciones de los residuos y el comportamiento dinámico de las proteínas, se analizaron simulaciones MD de 100 ns de los componentes de limitación y corrección del SARS-CoV-2. Los RMSD de las redes troncales, como uno de los criterios de estabilidad estructural durante las simulaciones, se calcularon en comparación con la estructura de referencia. Como se implica en la Fig. 3a, los RMSD de las estructuras tuvieron un aumento inicial, aumentaron durante los primeros 45 ns y luego permanecieron estables. Estos resultados indicaron que los cambios conformacionales fueron menores y que la unión de nsp14 y nsp10 fue estable. Nsp14 tenía mayores valores de RMSD que nsp10, lo que indica que era más flexible en la forma libre. Para analizar las fluctuaciones de los residuos, se calcularon los RMSF de los átomos de Cα. Se observaron valores más altos de RMSF en nsp10 principalmente en el bucle N-terminal (A1-V7), la hélice H1 (S11-F19) y en la región de la bobina y la hebra (V42-T47) (Fig. 3b). Las fluctuaciones más altas de la hélice H1 en nsp10 pueden considerarse como una indicación de su papel en la activación de ExoN de nsp14. En la estructura de nsp14, las regiones que median las interacciones con nsp10 mostraron más fluctuaciones que se ubicaron en el dominio N-terminal de la proteína. Las simulaciones de MD mostraron que dos dominios particulares de nsp14 estaban conectados a través de una región bisagra. Esta región bisagra puede separar la actividad ExoN y N7-MTas de nsp14. Los RMSD de la columna vertebral se calcularon con respecto a la estructura de referencia para el complejo nsp16-nsp10, así como con las formas libres de las proteínas nsp16 y nsp10 (Fig. 3a). Los valores de RMSD fueron relativamente estables después de 30 ns. Los valores promedio de RMSD para nsp16-nsp10, nsp16 y nsp10 fueron 3,6, 2,4 y 2,05 Å, respectivamente. A continuación, se calcularon los valores de RMSF para el complejo nsp16-nsp10, las proteínas nsp16 y nsp10 (Fig. 3b).

Gráficos de RMSD y RMSF para los complejos nsp14-nsp10 y nsp16-nsp10 del SARS-CoV-2 durante 100 ns de simulaciones de MD. (a) Gráfico RMSD para nsp14-nsp10, nsp14, nsp10, nsp16-nsp10 y nsp16, y (b) Gráficos RMSF para nsp10, nsp14, nsp14-nsp10, nsp16 y nsp16-nsp10.

Los resultados del análisis de los IBP establecen un contexto apropiado para el diseño de fármacos. Los resultados de los análisis antes mencionados nos llevaron a diseñar inhibidores de péptidos dirigiéndonos a las interacciones investigadas para alterar los mecanismos de limitación y corrección del SARS-CoV-2. Con este fin, en un enfoque inicial, dadas las interfaces proteína-proteína compartidas previstas de las interacciones nsp16-nsp10 y nsp14-nsp10 (Fig. 2c), los péptidos inhibidores que se dirigen tanto a la nsp16 2′O-MTasa del SARS-CoV-2 y nsp14 ExoN se diseñaron manualmente. Se diseñó un conjunto de inhibidores de péptidos de doble objetivo (19 péptidos), en lo sucesivo denominados péptidos superpuestos (OLP) con longitudes que varían de 4 a 8 (Tabla S6), en función de los residuos de interacción clave superpuestos predichos de nsp10 en SAR-CoV- 2, es decir, T39-T47, G69-S72, C77-H80 y K93-Y96. Mientras tanto, en un enfoque paralelo, se predijeron individualmente para cada complejo cuatro conjuntos de péptidos como segmentos calientes con energías de unión significativas utilizando el servidor Peptiderive. En total, 22 péptidos lineales (P-16-5 a P-16-15 y P-14-5 a P-14-15) (Tabla S7) y 16 péptidos cíclicos (Tabla S8) con las puntuaciones de interfaz relativas más altas (porcentaje ) fueron diseñados. Es notable que la comparación de los péptidos diseñados por las dos metodologías revelara cinco secuencias peptídicas similares. Los OLP, incluidos OLP-11, OLP-13, OLP-16, OLP-18 y OLP-19, y los péptidos diseñados por Peptiderive para apuntar a nsp16, incluidos P-16-5, P-16-6, P- 16-7, P-16-8 y P-16-9 tienen las mismas secuencias. Es importante destacar que en este estudio solo se consideraron los péptidos lineales y se evaluaron más a fondo. Para evaluar los péptidos cíclicos predichos se requiere otro estudio de investigación.

Se utilizó el acoplamiento molecular para investigar las posiciones y energías de unión de los péptidos inhibidores diseñados con la proteína objetivo. El procedimiento de atraque incluyó dos pasos. En el primer paso, HPEPDOCK realizó el acoplamiento péptido-proteína utilizando su algoritmo de acoplamiento local y especificando los residuos clave que interactúan del objetivo. Según los mejores criterios de selección del modelo, las puntuaciones de energía de acoplamiento de los 36 péptidos diseñados oscilaron entre -152,081 y -49,141, y entre -226,821 y -67,438 para el acoplamiento con nsp16 y nsp14, respectivamente (Tablas S6 y S7). Entre los OLP, OLP-13 cuando el objetivo era nsp16 y OLP-18 cuando el objetivo era nsp14 mostraron las puntuaciones de energía de acoplamiento más bajas (-148,518 y -135,334, respectivamente). Se seleccionaron los OLP con las puntuaciones de energía de acoplamiento más bajas para ambos objetivos. Para el segundo paso del acoplamiento, 14 de 36 péptidos diseñados con las puntuaciones de energía de acoplamiento más negativas, incluidos OLP-13, OLP-16, OLP-17, OLP-18, P-16-11, P-16-12, Se seleccionaron P-16-13, P-16-14, P-16-15, P-14-11, P-14-12, P-14-13, P-14-14 y P-14-15. .

Los resultados del acoplamiento péptido-proteína realizado por HADDOCK, incluida la puntuación HADDOCK, RMSD de la estructura general de menor energía, energía de Van der Waals, energía electrostática, energía de desolvatación y área de superficie enterrada para cada complejo péptido-objetivo, se informan en Tabla S9. Todos los péptidos estudiados interactuaron con nsp16 en casi las mismas posiciones con las que interactuó nsp10. Entre las interacciones OLPs-nsp16, OLP-18 y OLP-13 mostraron las puntuaciones más bajas de HADDOCK de - 65,8 ± 4,6 y - 50 ± 2,1 con grandes superficies enterradas de 1213,3 ± 29,8 y 950 ± 16,9 Å2, respectivamente. P-16-11 y P-16-13 mostraron las puntuaciones HADDOCK más negativas entre los péptidos diseñados específicamente para atacar la nsp16. Entre las interacciones OLPs-nsp14, OLP-18 y OLP-13 mostraron las puntuaciones más bajas de HADDOCK (- 41,1 ± 1,9 y - 39,1 ± 11,3, respectivamente). La puntuación HADDOCK más baja (- 99,4 ± 2,5) y la mayor superficie enterrada (1918,3 ± 24,4 Å2) se predijeron para el complejo P-14-15-nsp14. Las puntuaciones HADDOCK del acoplamiento de nsp10 con nsp16 y nsp14 se predijeron como referencia (-117,1 ± 2 y -123,4 ± 3, respectivamente).

En el siguiente paso, se calcularon ΔG y Kd del mejor modelo complejo péptido-objetivo para cada péptido (Tabla S9). El ΔG de cada complejo se comparó con el ΔG de la estructura de referencia. Los valores previstos de ΔG y Kd para SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 fueron −12,8 kcal/mol y 4,3 × 10−10 M, respectivamente. Entre los péptidos diseñados para apuntar a nsp16, P-16-15, P-16-14, P-16-12, OLP-18 y P-16-13, respectivamente, mostraron los valores de ΔG más bajos (el más negativo, el mejor afinidad). Los valores predichos de ΔG y Kd para nsp14 fueron −21,6 kcal/mol y 1,4 × 10−16 M, respectivamente. Los péptidos diseñados para apuntar a nsp14, es decir, P-14-15, P-14-14, P-14-13, P-14-12 y P-14-11, respectivamente, mostraron los valores de ΔG más negativos. Los valores de ΔG de OLP-13 y OLP-18 para las interacciones con nsp14 fueron los mismos (-8,9 kcal/mol). Los péptidos diseñados con valores de Kd más bajos tenían el potencial de unirse más fuertemente a su respectiva proteína objetivo. Además, la Tabla S9 muestra los resultados del análisis de descomposición de energía libre MM-GBSA de los complejos péptido-objetivo. Péptidos inhibidores de nsp16, incluidos OLP-18, P-16-12 y P-16-13, así como péptidos inhibidores de nsp14, incluidos P-14-15, P-14-14 y P-14-12. , mostraron las energías libres MM-GBSA más negativas, respectivamente. La contribución de energía de los péptidos diseñados por residuo se enumera en la Tabla S9. La menor energía de unión de un residuo indica su papel crítico en la interacción péptido-objetivo. En OLP-13-nsp16, OLP-13-nsp14, OLP-18-nsp16 y OLP-16-nsp14, la metionina en la posición 5 mostró la energía más baja en relación con otros residuos de los péptidos. Además, los 10 residuos principales de las proteínas diana con las energías más bajas se informan en la Tabla S9, y los 5 principales se muestran en las Figs. T24-S27. En las interacciones OLPs-nsp16, I40, M247, V44 y A83 fueron los residuos comunes de nsp16 con las contribuciones de energía más bajas y, en consecuencia, funciones más críticas. T25, P24 y F8 de nsp14 fueron residuos críticos comunes (con las energías más bajas) en todas las interacciones OLP-nsp14 (Tabla S9). La Tabla 2 resume los péptidos inhibidores diseñados, sus puntuaciones de acoplamiento previstas y las energías de unión.

Después de los análisis de energía de acoplamiento y unión de los péptidos diseñados, se analizaron las interacciones de los péptidos diseñados en la Tabla 2 con la proteína objetivo para obtener una mejor comprensión de los residuos clave que interactúan y sus tipos de interacción. Los residuos de la proteína diana en la interfaz involucrada en cada interacción péptido-diana se enumeran en la Tabla S9. Los residuos de nsp16, incluidos I40, M41, V44, T48, V78, A79, P80, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 y M247, fueron residuos comunes que estuvieron involucrados en todas las interacciones OLPs-nsp16. . Para P-16-11, P-16-12, P-16-13, P-16-14 y P-16-15, K38, G39, I40, V44, G77, V78, A79, A83, V84, Q87, V104, S105, D106, L244 y M247 de nsp16 eran residuos comunes en las interfaces de los complejos péptido-nsp16. Los residuos de interacción comunes de nsp14 en todas las interacciones OLP-nsp14 fueron F8, A23, Q22, P24, T25, D126, T127 y T131. Además, V4, L7, F8, P20, T21, A23, P24, T25, H26, C39, V40, D41, F60, K61, M62, N63, Y64 e I201 de nsp14 fueron comunes para mediar las interacciones de P-14. -11, P-14-12, P14-13, P14-14 y P-14-15 con nsp14.

Los mapas de interacciones para OLP-13 y OLP-18 con sus objetivos (nsp16 y nsp14) indicaron que las interacciones hidrofóbicas fueron las interacciones más abundantes en estos complejos OLP-objetivo (Fig. 4). El N1 de OLP-13 participó en tres enlaces H con A79, D106 y V104 de nsp16. Además, el M5 de OLP-13 formó un enlace H con Q87 de nsp16. El N1 de OLP-13 formó dos enlaces H con T5 y N3 de nsp14. Además, C2 de OLP-13 participó en dos enlaces H con G6 y L7 de nsp14. Se encontraron otros enlaces H entre K4 y L6 de OLP-13 y T25 y D126 de nsp14, respectivamente (Fig. 4a). El N1 de OLP-18 formó tres enlaces H con A79, G77 y V104 de nsp16. C2 y K4 de OLP-18 participaron en enlaces H con D106 de nsp16. K4, M5, C7 y T8 de OLP-18 formaron enlaces H con A83, Q87, L244 y K38 de nsp16, respectivamente. En la interacción OLP-18-nsp14, K4 formó dos enlaces H con D126 y P24 de nsp14. T8 y C2 participaron como donantes en los enlaces H con K61 y P20 de nsp14, respectivamente (Fig. 4b). Los mapas de interacciones para los otros péptidos se muestran en las Figs. T28-S31. Las interacciones hidrofóbicas fueron predominantes en estos complejos péptido-proteína. Además, en la figura S32 se muestran las fluctuaciones de los residuos en cada complejo proteína-péptido objetivo durante las simulaciones.

Los mapas de interacciones péptido-proteína para los péptidos OLP-13 y OLP-18 y sus objetivos (nsp16 y nsp14). ( a ) Interacciones péptido-proteína de OLP-13 con nsp16 (izquierda) y nsp14 (derecha) como proteínas diana. ( b ) Interacciones péptido-proteína de OLP-18 con nsp16 (izquierda) y nsp14 (derecha) como proteínas diana. Las líneas discontinuas negras y los arcos marrones con radios representan los enlaces de hidrógeno y los contactos hidrofóbicos, respectivamente.

Entre los péptidos diseñados, se seleccionaron para análisis adicionales OLP-13, OLP-18, P-16-11, P-16-13, P-14-14 y P-14-15 con las puntuaciones HADDOCK más negativas. (Figura 5). Estos péptidos con mejor puntuación se sometieron a una evaluación adicional después de simulaciones MD de 50 ns utilizando el método MM-PBSA para investigar las energías libres de unión y seleccionar los péptidos más prometedores. Los resultados de MM-PBSA se presentan en la Tabla 3. Los valores negativos de ΔG de unión de MM-PBSA para todos los péptidos analizados indicaron sus afinidades de unión favorables a las respectivas dianas. P-16-11 y P-14-14 mostraron los valores de unión de ΔG más bajos para nsp16 y nsp14 (- 30,4218 y - 33,6353 kcal/mol, respectivamente). Tanto OLP-13 como OLP-18 mostraron una mejor afinidad de unión, con una unión de ΔG más favorable a nsp16 (- 22,4568 y - 24,1671 kcal/mol) que a nsp14 (- 17,3694 y - 19,6176 kcal/mol).

Representaciones de estructuras en 3D de los péptidos diseñados con mejor puntuación para las proteínas diana (nsp16 y nsp14). Los residuos y péptidos clave que interactúan están coloreados en rojo y turquesa, respectivamente.

Después de los dos pasos de acoplamiento molecular y luego del análisis de energía libre de unión mediante MM-PBSA, se seleccionaron los seis péptidos con mejor puntuación (Fig. 5) como secuencias peptídicas principales para un análisis integral de mutagénesis de saturación in silico para identificar los péptidos con afinidades de unión mejoradas mediante MM-PBSA. investigar los efectos de cada mutación en la afinidad de unión del péptido-objetivo diseñado. En este sentido, se generó una gran biblioteca de inhibidores de péptidos con 1539 nuevas secuencias de péptidos mutando cada residuo de seis secuencias principales en los otros 19 aminoácidos (Tabla S10). La afinidad ΔΔGA positiva del mutante en relación con el tipo salvaje indicó un impacto mejorado de esta mutación en la afinidad del péptido-objetivo. Para OLP-13 y OLP-18, el 17,5% y el 34,8% de las sustituciones mostraron una afinidad ΔΔGA positiva con mejores impactos en las interacciones péptido-nsp16, respectivamente. Sin embargo, sólo el 0,06% y el 0,07% mostraron una afinidad ΔΔGA considerable (> 0,5 kcal/mol). Para las interacciones OLP-13-nsp14 y OLP-18-nsp14, el 15% y el 40% de las mutaciones mostraron impactos mejorados con ΔΔGAffinity positivo, respectivamente. La mutación de los residuos peptídicos a fenilalanina, triptófano y tirosina mostró los mayores impactos de mejora de estas variaciones en la afinidad del péptido-objetivo con la afinidad ΔΔGA más positiva (color azul). Sin embargo, estos aminoácidos disminuyeron la afinidad de unión prevista en algunas posiciones, como las sustituciones en N1, K4 y M5 de OLP-13 o K4 y M5 de OLP-18 en la interacción con nsp16 (Fig. 6a). La mutación de C2 y K4 de OLP-13 en complejo con nsp14 con los otros 19 aminoácidos resultó en una afinidad ΔΔGA negativa (colores rojos) con impactos decrecientes, lo que demuestra las funciones críticas de estos residuos en la interacción OLP-13-nsp14 (Fig. 6b ). En la figura S33 se muestran mapas de calor que representan la mutagénesis de saturación in silico de otros péptidos principales. Además, para obtener los péptidos inhibidores optimizados, se predijeron las propiedades fisicoquímicas, farmacocinéticas y de toxicidad de los péptidos diseñados. Estas propiedades se detallan en la Tabla S11. La predicción de alergenicidad clasificó los péptidos diseñados como alérgenos probables y no alérgenos probables. Además, el análisis de toxicidad clasificó todos los péptidos diseñados como no tóxicos, excepto P-16-11, P-16-12 y P-16-13.

Mapas de calor que representan el análisis de mutagénesis de saturación in silico de los péptidos inhibidores de OLP-13 y OLP-18. (a) Interacciones OLP-13-nsp16 y OLP-18-nsp16, y (b) Interacciones OLP-13-nsp14 y OLP-18-nsp14. Las mutaciones con impactos mejorados (ΔΔGAffinity positivo) y decrecientes (ΔΔGAffinity negativo) en la afinidad de unión del péptido-objetivo se muestran en azul y rojo, respectivamente.

Para identificar los inhibidores peptídicos del pancoronavirus, se analizó entre los CoV la conservación de los residuos diana que se identificaron para interactuar con los péptidos diseñados. El análisis de alineación de secuencias múltiples de nsp16 de siete CoV humanos, es decir, SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-229E (Fig. S34a), reveló que los residuos de nsp16, incluidos G39, A79, P80, V84, V104, S105 y D106 que interactúan con péptidos, eran idénticos en estos CoV. I40, M41, T48, G77, V78, A83, Q87, L244 y M247 de nsp16 eran residuos similares. I40 fue reemplazado por cisteína tanto en HCoV-OC43 como en HCoV-HKU1 nsp16, y por valina en MERS-CoV nsp16. En nsp16 de MERS-CoV, M41, T48, V78 y M247 fueron reemplazados por histidina, metionina, isoleucina y leucina, respectivamente. En HCoV-HKU1, G77 fue reemplazado por ácido glutámico. A83 fue reemplazado por serina en MERS-CoV y por treonina en HCoV-NL63. En nsp16 de HCoV-NL63 y HCoV-229E, L244 y M247 fueron reemplazados por valina y leucina, respectivamente. A continuación, se analizó la conservación del complejo nsp16-nsp10 entre cuatro CoV (SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV y HCoV-OC43) (Tabla S12). G39, T48, V84, S105 y D106 de nsp16 fueron los residuos más conservados con una puntuación de conservación de 9 (magenta oscuro). Otros residuos clave de nsp16, incluidos I40, M41, V44, G77, V78, A79, P80, Q87, V104 y L244, estaban bien conservados, con puntuaciones de conservación de 6 a 8 (rosa). Entre los residuos investigados, K38 fue un residuo muy variable con una puntuación de 1 (turquesa). A83 y M247 de nsp16 estaban conservados intermediamente o eran variables (de blanco a turquesa) (Fig. S34b). El análisis de alineación de secuencias múltiples de nsp14 entre los siete CoV mostró que L7, F8, P20, A23, V40 y F60 de nsp14 eran residuos idénticos. V4, Q22, P24, T25, C39, D41, K61, M62, N63, T127 e I201 de nsp14 eran residuos similares (Fig. S35a). L7, P20, A23, T25 y F60 fueron los residuos altamente conservados con una puntuación de 9 en nsp14. F8, C39, V40, D41, K61, M62, N63 y T127 estaban bien conservados (con puntuaciones de 6 a 8). V4, Q22, P24, H26, Y64, D126, T131, I201, D41 de nsp14 eran residuos variables. T21 era un residuo intermedio (con una puntuación de 5) (Fig. S35b; Tabla S12). Además, los resultados del análisis de conservación de la proteína nsp10 en CoV se muestran en la Fig. S36 y la Tabla S12.

En este estudio, consideramos los PPI en RTC, centrándonos particularmente en las funciones de nsp14 y nsp16 y su cofactor crítico común, nsp10. Las interacciones de nsp10 con nsp14 y nsp16 demostraron su papel activador central en la supervivencia y patogénesis de los CoV (Fig. 1a). Apuntar a estos dos IPP es importante en varios aspectos. El gran tamaño del genoma de los CoV justifica el requisito de actividad ExoN. La capacidad de RdRp para seleccionar correctamente los nucleótidos es insuficiente para proporcionar fidelidad de replicación, lo que confirma la importancia de la actividad de corrección de ExoN de nsp1474. La interacción de nsp14 con nsp10 fortalece su actividad ExoN hasta 35 veces in vitro75. Además, la interferencia con el último paso del proceso de limitación en el SARS-CoV-2 (Fig. 1b) tiene el potencial de bloquear los mecanismos de replicación, traducción y escape viral. Los estudios han demostrado la inhibición de la actividad enzimática de nsp16 en CoV por péptidos derivados de nsp10 del SARS-CoV26 y del virus de la hepatitis de ratón (MHV)27.

Para diseñar los inhibidores peptídicos en el punto de partida del flujo de trabajo (Fig. S3), se predijeron los residuos clave que median las interacciones de nsp10 con nsp14 ExoN y nsp16 2'-O-MTase (Fig. 2 y Tabla 1). Todos los residuos clave que interactúan de nsp14 se extendieron hacia su dominio N-terminal ExoN. Esto indica que es posible que nsp10 no participe en la activación de N7-MTasa y también puede revelar las funciones separadas de los dominios nsp14. Estos resultados estuvieron en consonancia con los estudios que mostraron la función independiente de nsp14 ExoN y N7-MTasa mediante el análisis de hidrólisis76, así como el análisis bioquímico77. Además, los resultados de las simulaciones de MD mostraron que una región bisagra separaba los dos dominios de nsp14. Además, una mayor flexibilidad de estas regiones puede reflejar su papel en la mediación de los IPP. Debido a la naturaleza dinámica del bucle, los bucles tanto en el terminal N como en el terminal C de nsp10 mostraron una mayor flexibilidad en comparación con otros residuos. Es importante destacar que la comparación de los residuos clave que interactúan en estos dos IBP indicó que 24 residuos en nsp10 interactuaron tanto con nsp16 como con nsp14 en el SARS-CoV-2 (Fig. 2c). Los análisis de mutagénesis y BRET también se han utilizado para mapear las interacciones superpuestas de nsp10 en el SARS-CoV78. La característica única de estos residuos clave que interactúan superpuestos sirve como una ventana para atacar dos proteínas clave (nsp16 y nsp14) con un inhibidor (OLP). Bouvet et al.78 demostraron que las mutaciones K43A e Y96F en nsp10, denominadas “fenotipo mutador”, aumentan las mutaciones del SARS-CoV. Además, las mutaciones en nsp10 disminuyeron o pusieron fin a la activación de ExoN75. Los resultados del análisis CAS (Fig. S9) son consistentes con estos informes. Los estudios han demostrado que la inactivación de ExoN de nsp14 en CoV mitiga la fidelidad de la replicación hasta 20 veces y la ausencia de actividad de ExoN ha mejorado la sensibilidad a la mutagénesis letal en presencia de mutagénesis de ARN79. La explicación de las similitudes y distinciones de los residuos interfaciales y de puntos críticos entre el SARS-CoV-2 y otros CoV (Figs. S6-S8) contribuirá a la preparación futura para posibles nuevos CoV emergentes. Además, este estudio es el primero que predijo los residuos clave que interactúan (Fig. S8) y su mapa de interacciones (Fig. S17) y también realizó el análisis de conservación (Tabla S12) en la estructura recientemente informada del HCoV-OC43. complejo nsp16-nsp1033.

Las grandes áreas de interfaz quedaron enterradas tras la formación de los complejos nsp14-nsp10 y nsp16-nap10. Por lo tanto, estas grandes áreas de interfaz con una gran cantidad de residuos clave que interactúan demostraron que estos IBP se dirigen a péptidos de interferencia en lugar de moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas enfrentan desafíos al participar en estas grandes áreas para competir con la interacción del socio original (nsp10). Además, los mapas de las interacciones de los residuos revelaron los complicados enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas (Fig. S14), lo que implica que abordar estas interacciones hidrofóbicas con moléculas pequeñas puede ser más desafiante e incluso improbable. Por otro lado, el tamaño más pequeño de los péptidos diseñados en relación con nsp10 puede proporcionar un beneficio en la unión competitiva debido a que son efectivamente mayores en la concentración en la interfaz y, en consecuencia, mejoran su afinidad.

A continuación, según los resultados del análisis de los IBP, los inhibidores peptídicos se diseñaron computacionalmente para apuntar a los mecanismos de corrección y limitación del ARN en el SARS-CoV-2 (Tablas S6 a S8). Luego, se evaluaron los péptidos diseñados (Tabla S9). Entre los OLP, OLP-18 (NCVKMLCT) y OLP-13 (NCVKML) mostraron las puntuaciones de acoplamiento y las energías de unión más bajas, involucraron una gran cantidad de residuos objetivo críticos en las interacciones, mostraron posturas de unión adecuadas y propiedades aceptables. Las interacciones péptido-proteína fueron en su mayoría hidrofóbicas (Fig. 4), similares a las interacciones nativas (Fig. S14). No hubo correlación general entre la longitud del péptido y la energía libre de unión para los péptidos diseñados cuando nsp16 era la proteína objetivo. Sin embargo, las energías libres de unión de los péptidos cuando nsp14 era el objetivo mostraron una correlación directa con la longitud del péptido (Tabla 2). Además, las puntuaciones de HADDOCK de todos los péptidos analizados fueron más altas que las de las interacciones nativas. Por lo tanto, para identificar los péptidos que se unen más fuertemente con una unión de ΔG cercana o menor que el compañero nativo (nsp10), los péptidos diseñados se optimizaron mediante análisis de mutagénesis de saturación in silico y se generó una nueva biblioteca de péptidos (Tabla S10). Utilizando este análisis mutacional computacional, se revelaron las sustituciones con la afinidad ΔΔGA más positiva (Figs. 6 y S33). Estos mutantes, como candidatos preseleccionados, lanzan una nueva ronda de estudios computacionales complementarios empleando los métodos descritos en este estudio para evaluar los péptidos recientemente diseñados. Además, el análisis de conservación reveló la conservación de los residuos objetivo que interactuaron con los péptidos diseñados (Figs. S34 y S35; Tabla S12). Por lo tanto, de acuerdo con la naturaleza conservada de los residuos diana, los péptidos diseñados tienen el potencial de funcionar como inhibidores de pancoronavirus y pueden ser útiles para posibles CoV recientemente surgidos. Además, los péptidos cíclicos informados en este estudio merecen una mayor investigación computacional.

La S-adenosil-l-homocisteína como coproducto de la reacción MTasa, la sinefungina y el ácido aurintricarboxílico (ATA) se identificaron como inhibidores de la unión del sustrato nsp16 de los CoV. SAM es utilizado como donante de metilo por varias MTasas celulares del huésped. Los inhibidores del sitio de unión de SAM impactan en la actividad 2'-O-MTasa del huésped, lo que produce efectos citotóxicos inducidos80. En este estudio, se apuntó al sitio único de interacción viral. Por tanto, los péptidos diseñados pueden ser más selectivos y eficaces que los miméticos de SAM. Hasta donde sabemos, actualmente no hay disponible ningún inhibidor del péptido nsp14 para CoV, y este estudio representa el primer esfuerzo computacional. La eliminación del 5'-monofosfato de ribavirina como análogo de guanosina de los sustratos de ARN mediante el complejo nsp14-nsp10 explica su escasa actividad contra los CoV. En el fenotipo mutador de nsp14 con inactivación de ExoN, Ribavirina mostró 20081 y Remdesivir mostró una sensibilidad 4,5 veces mayor82. Además de estos estudios, aquí se sugiere la terapia combinada de análogos de nucleósidos (NA) con esta primera generación de inhibidores peptídicos diseñados para nsp14 (Fig. 7). Independientemente de las limitaciones de los péptidos, vale la pena explorar esta estrategia propuesta. Además, se prevé que la terapia propuesta complemente los efectos antivirales de los NA y podría desencadenar la inhibición tanto de la replicación del ARN como de los mecanismos de corrección del ARN. Además, cuando se desarrolla resistencia a Remdesivir como resultado de mutaciones RdRp, se prevé que los péptidos diseñados probablemente podrían aumentar la eficacia de Remdesivir sin aumentar el riesgo de resistencia83. Sin embargo, aún se desconocen algunos aspectos importantes desde el punto de vista molecular y bioquímico, y los péptidos diseñados requieren más estudios computacionales y experimentales. Se requieren más investigaciones para estudiar las actividades de los péptidos propuestos in vitro e in vivo, así como para evaluar su especificidad, eficacia y farmacocinética. Además, al considerar los péptidos diseñados como posibles agentes terapéuticos para pacientes con COVID-19, se sugiere investigar su sistema de administración, particularmente las estrategias de administración preferidas, como la subcutánea o intravenosa, similar a los péptidos aprobados recientemente por la FDA84. Además, para evadir la inmunidad del huésped, los péptidos podrían generarse en pacientes con COVID-19 utilizando ARNm85 transcrito in vitro (IVT).

Esquema que representa la estrategia propuesta para la terapia combinada de análogos de nucleósidos (NA) con los inhibidores peptídicos diseñados por nsp14 ExoN. Se propone la terapia combinada de ribavirina, remdesivir u otros NA con los inhibidores del péptido ExoN nsp14 diseñados en este estudio para completar los efectos antivirales de los NA para bloquear tanto la replicación del ARN como los mecanismos de corrección del ARN.

Los CoV han sido la causa de síndromes respiratorios humanos durante muchos años. La pandemia mundial de COVID-19 ha provocado muchas complicaciones económicas y de atención médica en los últimos años. Esto resalta la importancia de estudiar las bases estructurales y moleculares del SARS-CoV-2 con una alta tasa de infección para el desarrollo de vacunas y terapias. Además del reconocimiento de receptores, el estudio de cada punto del RTC y, en particular, de los IBP de nsps, conduce al diseño de antivirales que interfieren específicos, como inhibidores de péptidos, con el potencial de atacar un sitio de interacción viral único. La superposición de interfaces proteína-proteína entre nsp16-nsp10 con actividad de limitación y nsp14-nsp10 como guardián de la replicación con actividad de corrección hace que estos IBP sean objetivos prometedores para diseñar antivirales para CoV. Perturbar el paso de formación de la cap-1 del SARS-CoV-2 tiene el potencial de alterar la actividad de la 2′-O-MTasa y posiblemente hacer que los ARNm virales sean más propensos a ser influenciados por sensores de proteínas clave para iniciar las respuestas inmunes más tempranas contra la infección viral. Los sensores celulares, como los receptores tipo peaje (TLR), el gen I inducible por ácido retinoico (RIG-I) y la proteína 5 asociada a la diferenciación del melanoma (MDA5), reconocen los ARN que carecen de 2'O-metilo en el primer nucleótido e inducen la señalización. cascadas que resultan en la expresión y liberación de citocinas e interferón tipo I16. Este estudio proporciona información completa sobre los residuos clave que median las interacciones de nsp10 como cofactor dual con nsp16 2′O-MTasa y nsp14 ExoN en el SARS-CoV-2 y otros CoV, que son útiles para diseñar nuevas terapias para combatir las actuales o futuros CoV. Los resultados de los PPI mostraron que 24 residuos que interactúan son comunes en las interfaces PPI de estos complejos. Por lo tanto, se diseñaron, evaluaron y luego optimizaron OLP con potencias inhibidoras duales. La conservación prevista de los residuos clave objetivo ofrece una nueva dirección para el diseño de inhibidores de pan-coronavirus. Los esfuerzos para desarrollar y optimizar con éxito los péptidos del estudio actual pueden convertirlos en una nueva generación de candidatos antivirales para el tratamiento de la COVID-19 o futuros posibles brotes relacionados.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Departamento de Biología y Microbiología Celular y Molecular, Facultad de Ciencia y Tecnología Biológicas, Universidad de Isfahán, Isfahán, Irán

Fatemeh Arabi-Jeshvaghani, Fatemeh Javadi-Zarnaghi y Mohamad Reza Ganjalikhany

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FA, FJ y MRG diseñaron el estudio. FA recopiló los datos. FA, FJ y MRG analizaron y discutieron los resultados. FA escribió el manuscrito. FJ y MRG revisaron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Fatemeh Javadi‐Zarnaghi o Mohamad Reza Ganjalikhany.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Arabi-Jeshvaghani, F., Javadi‐Zarnaghi, F. & Ganjalikhany, MR Análisis de interacciones proteína-proteína críticas de las maquinarias moleculares de limitación y corrección del SARS-CoV-2 para el diseño de péptidos inhibidores de doble objetivo. Representante científico 13, 350 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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Recibido: 07 de agosto de 2022

Aceptado: 20 de diciembre de 2022

Publicado: 07 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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